强大的DNA操纵:改进的基因编辑与新的理解CRISPR-Cas9工具

CRISPR-Cas9基本编辑器

碱基编辑器的3D结构,由Cas9蛋白(白色和灰色)和脱氨酶蛋白(红色和粉色)组成,Cas9蛋白与RNA导向物(紫色)互补的DNA靶点(teal和蓝色螺旋)结合,脱氨酶蛋白将一个核苷酸转换为另一个核苷酸。图片来源:加文·诺特和奥德隆·拉皮纳特拍摄的加州大学伯克利分校图片

Cryo-EM捕获活动中的CRISPR-Cas9碱基编辑器。

在短短八年内,CRISPR-Cas9就成为了基础研究和基因治疗的基因组编辑。但CRISPR-Cas9也产生了其他潜在的强大功能脱氧核糖核酸可以帮助修复导致遗传疾病的基因突变的操纵工具。

研究人员在加州大学伯克利分校现在,他们已经获得了这些工具中最有希望的工具之一的第一个3D结构:碱基编辑器,它与DNA结合,而不是切割,精确地用一个核苷酸替换另一个核苷酸。

碱基编辑器于四年前问世,目前已被用于纠正人类基因组中的单核苷酸突变。目前可用的碱基编辑器可以解决大约60%的已知遗传疾病——可能超过15000种遗传疾病——都是由一个核苷酸的突变引起的。

详细的3D结构,发表在7月31日的《华尔街日报》上科学,提供了一个调整碱基编辑器的路线图,使它们在患者中使用时更加通用和可控。

加州大学伯克利分校博士后加文·诺特说:“我们第一次能够观察到一个碱基编辑器的活动。”“现在我们不仅可以理解它什么时候起作用,什么时候不起作用,还可以设计下一代碱基编辑器,使它们更好,更适合临床。”

碱基编辑器是Cas9融合蛋白的一种,它使用部分失活的Cas9——其剪切剪刀被禁用,因此只能剪切一条DNA链——和一种酶,例如,激活或沉默一个基因,或修改DNA的邻近区域。由于这项新研究首次报告了Cas9融合蛋白的结构,它可能有助于指导无数其他基于Cas9的基因编辑工具的发明。

“我们第一次看到碱基编辑器作为两个独立的模块:Cas9模块为你提供特异性,然后你有一个催化模块为你提供活性,”Audrone Lapinaite说,他曾是加州大学伯克利分校博士后,现在是亚利桑那州立大学坦佩分校的助理教授。“我们得到的碱基编辑器与目标结合的结构确实给了我们一种思考Cas9融合蛋白的方法,总的来说,让我们知道Cas9的哪个区域更有利于融合其他蛋白质。”

拉皮纳特和诺特最近接受了澳大利亚莫纳什大学研究员的职位,他们是这篇论文的第一作者。

“这种结构帮助我们在更深层次上理解碱基编辑器,”资深作者、加州大学伯克利分校分子和细胞生物学及化学教授、霍华德休斯医学研究所研究员詹妮弗·杜德纳说。yabovip2021yabo124“现在我们可以看到我们在做什么,我们可以制定明智的策略来改善这个系统。”

一次编辑一个基

2012年,研究人员首次展示了如何重组细菌酶Cas9,并将其转化为从细菌到人类所有类型细胞的基因编辑工具。CRISPR-Cas9是杜德纳和她的法国同事艾曼纽·卡彭蒂耶(Emmanuelle Charpentier)的创意,它改变了生物学研究,几十年来首次将基因治疗引入了临床。

3D结构CRISPR Cas9 Base Editor

碱基编辑器编辑一段DNA时的3D结构。图片来源:加州大学伯克利分校,Gavin Knott

科学家很快选择了Cas9来生产一系列其他工具。基本上是蛋白质和蛋白质的混合物核糖核酸Cas9精确地瞄准特定的DNA片段,然后像剪刀一样精确地剪断它。然而,剪子功能可能会被破坏,使Cas9能够靶向并结合DNA而无需切割。通过这种方式,Cas9可以将不同的酶运送到DNA的目标区域,从而允许酶操纵基因。

2016年,哈佛大学、麻省理工大学博德研究所和哈佛大学的David Liu将Cas9与另一种细菌蛋白结合起来,实现了一种核苷酸与另一种核苷酸的精确替换:第一个碱基编辑器。

虽然早期的腺嘌呤碱基编辑器速度很慢,但最新版本ABE8e速度惊人:它在15分钟内完成了近100%的预期碱基编辑。然而,ABE8e可能更容易在试管中编辑非预期的DNA片段,从而可能产生所谓的偏离目标效应。

这一新发现的结构是通过一种称为cryo电子显微镜(cryoEM)的高性能成像技术获得的。活性分析表明为什么ABE8e容易产生更多的非靶向编辑:与Cas9融合的脱氨酶蛋白始终是活性的。当Cas9在细胞核周围跳跃时,它会结合并释放成百上千的DNA片段,然后才能找到目标。附加的脱氨酶就像一门松动的大炮,不需要等待完美的匹配,通常会在Cas9停在最终目标上之前编辑一个基地。

知道效应器结构域和Cas9是如何连接的,可以导致重新设计,使酶只有在Cas9找到目标时才具有活性。

拉皮纳特说:“如果你真的想设计出真正特异的融合蛋白,你必须找到一种方法,使催化结构域更多地成为Cas9的一部分,这样它才能感觉到Cas9在正确的靶点上,然后才被激活,而不是一直处于激活状态。”。

ABE8e的结构还精确地指出了脱氨酶蛋白的两个具体变化,这使得它比早期版本的碱基编辑器ABE7.10工作得更快。这两个点突变允许蛋白质更紧密地抓住DNA,更有效地用G取代A。

“作为一名结构生物学家,我真的想研究一个分子,并思考如何合理地改进它。这种结构和伴随的生物化学确实给了我们这种力量,”诺特补充说。yabovip2021“我们现在可以对这个系统在细胞中的行为做出理性预测,因为我们可以看到它,并预测它将如何崩溃,或预测改善它的方法。”

“虽然基本编辑器现在广泛用于精确的生物从细菌的变化介绍给植物灵长类动物,没有人曾观察到一个基本编辑器的三维分子结构,”刘说,他1999年从加州大学伯克利分校获得博士学位,霍华德·休斯医学研究所研究员。“这个合作项目揭示了一种最先进的、高度活跃的碱基编辑器——ABE8e——在参与目标DNA位点的行为中捕捉到的美丽的分子结构。”

参考文献:“crispr - cas9引导腺嘌呤碱基编辑器捕捉DNA”,Audrone Lapinaite, Gavin J. Knott, Cody M. Palumbo, Enrique Lin-Shiao, Michelle F. Richter, Kevin T. Zhao, Peter a . Beal, David R. Liu和Jennifer a . Doudna, 2020年7月31日,《科学》。
DOI: 10.1126 / science.abb1390

除了Lapinaite、Knott、Doudna和Liu之外,其他论文的合著者还有加州大学戴维斯分校的Cody Palumbo和Peter Beal、加州大学伯克利分校的Enrique Lin Shiao以及哈佛大学和麻省理工学院合作的博德研究所的Michelle Richter和Kevin Zhao。

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